标准的PCR实验室规划设计

[发布时间：2020-05-07 14:59:21 阅读次数：982次]

    

标准的PCR实验室规划设计

　　PCR实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。用于基因检测，具有高度敏感性、特异性、快速、简单等特点，能将传统方法难以检测的极少数病毒DNA片段扩增百万倍以上，从而大大提高疾病的诊断水平。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方.又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

　　标准的实验室设计规划：

　　1、PCR实验室平面布局

　　PCR扩增检验实验室原则上分为三个单独的工作区域：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增和扩增产物分析区。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增和扩增产物分析区。各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。

　　2、实验室空调通风系统设计及压力控制

　　PCR实验室并没有严格的净化等级要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。

　　(1)试剂贮存和准备区

　　该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于样品制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。对与气流压力的控制，本区应对外界保持微正压。

　　(2)标本制备区

　　该区域主要进行的操作为样本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定DNA的合成。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。

　　(3)扩增和扩增产物分析区

　　该区域主要进行的操作为DNA扩增和扩增片段的测定。此外，已制备的DNA模板(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。

　　3、污染的预防与控制

　　PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中，常见的有以下几种污染类型：扩增产物的污染;天然基因组DNA的污染;试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染，实验就必须停止，直到找到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐，浪费人力物力。因此要避免污染，首先应是预防，而不是排除。

　　(1)工作区域的严格划分

　　各个实验区域设置合理;各个实验区域要有明显的标记(如醒目的门牌或不同的地面颜色等)，以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。

　　(2)合理的系统设置

　　合理的空调通风系统设置，尽量采用全送全排的空调系统;严格的气流压力控制，保证不同的实验区内不同的压力要求。

　　(3)规范的操作

　　扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训，经培训合格后才能从事临床基因扩增检验的工作;在实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施;清洁工作及时、正确。实验工作结束后，必须立即对本区进行清洁。除常规的****液体对表面进行擦拭****或紫外线灯的照射****外，对一些实验设备还应进行高压****处理。

　　(4)严格的管理

　　严格控制进出实验室的人员。与实验无关的人员不得随意进出实验室，有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门;尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性;扩增产物分析区是**主要的扩增产物污染来源，废液不能在实验室中倾倒，必须经****液浸泡****后在远离实验室的地方弃掉，用过的吸头等一次性材料也应经****液浸泡****后统一处理，如焚烧等;扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。

　　(5)完备的实验室配套设施

　　完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件，应根据各个实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器，如超净工作台、离心机、加样器等。

　　疾控中心PCR实验室基本要求

　　1、PCR实验室依据所使用的方法可分为试剂准备、标本制备、扩增、产物分析等三或四个区域。只是使用实时荧光PCR仪、HIV病毒载量测定仪的PCR实验室，有上述前面三个区域即可。各区域应完全独立分隔，不应有任何的空气直通。

　　2、产物分析区或三个区域的**后一个区域(即扩增及产物分析区)，空气流向应由室外向室内，可通过在室内设置通风橱、排风扇或其他排风系统达到空气流由室外向室内流动的要求。

　　3、PCR实验室各区域仪器设备配备通常如下：

　　(1)试剂准备区仪器设备主要应有加样器、冰箱、天平、低速离心机、混匀器、可移动紫外灯等。可使用超净工作台作为试剂配制操作台面。

　　(2)标本制备区仪器设备主要应有生物安全柜(****为B2，可避免提取核酸在柜内反复循环，造成标本间交叉“污染”，出现假阳性结果。此外还应配备加样器、台式高速离心机(冷冻及常温)、台式低速离心机、恒温设备(水浴和/或干浴仪)、冰箱、混匀器和可移动紫外灯等。

　　(3)扩增区主要仪器就是核酸扩增热循环仪(PCR仪，实时荧光或普通的)。热循环仪的电源应专用，并配备一个稳压电源或UPS，以防止由于电压的波动对扩增测定的影响。此外，根据工作需要，还可配备加样器、超净台等。

　　(4)产物分析区：本区所使用的仪器设备可能有加样器、电泳仪(槽)、电转印仪、杂交炉或杂交箱、水浴箱、DNA测序仪、酶标仪和洗板机等。